紫外消毒30min后關閉紫外燈,開啟超凈臺正常工作狀態(tài),用酒精消毒操作者的雙手.將所需的培養(yǎng)基,胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺面內,點燃酒精燈,將培養(yǎng)基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后,再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次,旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋,分別放于酒精燈的兩側.特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上,瓶口對準酒精燈,且放在距離酒精燈最近的位置,瓶蓋置于酒精燈的另一側

 

　　將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次,旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次,蓋放于酒精燈右側后將培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液懸空倒進污缸,在酒精燈消毒2-3次瓶口,豎直放好.取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次,然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液,懸空移入培養(yǎng)瓶內

 

　　將培養(yǎng)使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層,計時約40s,立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙,并有1-2個細胞脫落,這時為胰酶消化的最適時機.若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度;若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落,則需繼續(xù)消化,輕輕的迅速平放培養(yǎng)瓶使胰酶浸沒細胞層1s后迅速豎起對著燈光觀察細胞情況,可反復幾次,直至出現針孔樣縫隙和1-2個細胞脫落的最佳消化狀態(tài).用移液器將胰酶吸凈

 

　　吸取1ml細胞凍存液于培養(yǎng)瓶內,并用移液器吸取少量的培養(yǎng)基輕柔的反復沖洗培養(yǎng)瓶壁5-8次,使貼壁細胞完全脫落于培養(yǎng)基內再輕輕吹打2-3次,使細胞盡可能處于單個懸浮狀態(tài).將1ml含有細胞的凍存液移入新的保種管內,擰緊瓶蓋,做好實驗標記

 

　　將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊,熄滅酒精燈,整理實驗臺面,取出實驗試劑及污缸等,關閉超凈工作臺.將保種管先放于4℃冰箱30min后拿出放置-20℃冰箱過夜,次日再放于-80℃的冰箱內3-4天,最后存放于-196℃的液氮灌內長期保存

 

　　注此過程也可簡化因實際操作過程中經驗所得:步驟7結束后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內4-5天,即可放于液氮灌保存.但-80℃冰箱也可保存細胞株2-3月